requestId:68b8d480ea2fa8.02497531.
中國網/中國成長門戶網訊 工程細胞是綠色生物制造的“芯片”，在醫藥、化學品、資料、燃料等各類物資的生物加工經過歷程中充任焦點履行者腳色。今朝，工程細胞的構建往往依托design—構建—測試—進修（DBTL）輪迴戰略，起首基于先驗常識和盤算模子design生物分解途徑，應用基因分解、組裝和編纂等技巧停止工程細胞的構建，進而對所構建工程細胞停止測試，如基因型測試，以及包含細胞發展、目的產品產量和東西的品質在內的表型測試，最后對測試成果停止綜合評價剖析，用于進一個步驟優化design，進步工程細胞任務效力。由于性命體系的復雜性，人們對代謝收集和多條理調控機制認知無限，往往需求構建海量基因型停止年夜範圍表型測試，才幹取得機能優勝的工程細胞底盤。是以，在DBTL輪迴中，工程細胞的高通量表型測試是最為要害的環節之一。
儀器裝備是完成工程細胞高通量表型測試的基本。縱不雅工程細胞表型測試技巧與設備成長過程，經過的事況了平板、微孔板、主動化任務站和微流控4個階段。19世紀80年月，為清楚決試管或燒瓶中單克隆難以察看和操縱的題目，德國微生物學家Julius Richard Petri發現了Petri平板培育皿，開啟了平板測試時期，這種用于單克隆分別培育的平板技巧沿用至今。跟著測試通量需求的進步，20世紀50年月，德國微生物學家Gyula Takatsy發現了微孔板測試方式，集成單克隆培育與檢測，通量普通為103/天—104/天。由于微孔板操縱耗時耗力，20世紀80年月，主動化任務站時期到來，并在后期逐步構成集成克隆挑取、孔板培育、檢測、挑選主動化操縱模塊于一體的集成平臺，天天完成104—105樣品高通量測試。20世紀90年月，Manz等初次提到微流控這一詞匯，界說為一種在微納米標準空間中準確把持和把持微納米流體的迷信技巧。21世紀初，微流控技巧迎來迅猛成長，由于樣品操縱體積小、檢測參數多樣（如熒光、散射光、吸光度、拉曼）、檢測通量高（天天測試樣品最高到達108—109）、本錢低（試劑耗費比微孔板下降可達106倍）等宏大上風，微流控設備成為工程細胞高通量表型測試研討熱門。面向分解生物學單細胞剖析與高通量挑選等表型測試需求，近年來成長了非培育類型的單細胞測試、培育類型的液滴微流控測試與微腔室測試技巧與設備，為分解生物學的成長供給了主要的設備支持。總的來說，微流控技巧的利用，代表了工程細胞表型測試技巧與設備高通量、主動化、微型化、集成化、多參數的成長趨向。本文將重點論述基于微流控技巧的非培育類型與培育類型工程細胞高通量表型測試技巧與設備研討停頓，并瞻望其成長標的目的，為面向綠色生物制造的工程細胞表型測試供給鑒戒。
單細胞高通量表型測試技巧與設備
單細胞表型測試技巧是指基于單細胞本身特徵如光學性質、胞內代謝產品、外形特征、毒性耐受、電學性質等的檢測與分選技巧。經由過程散射光與熒光、質譜電子訊號、拉曼光譜、顯微成像、磁電子訊號等技巧辨認目的細胞信息后，應用電場、磁場、光場、聲場、流膂力場、重力場等方式驅動細胞向搜集處活動，終極分選出目的單細胞。下文對4類典範的單細胞表型測試技巧與設備停止總結。
熒光激活細胞分選技巧與設備
熒光激活細胞分選（fluorescence activated cell sorting，FACS）是對熒光標誌的單細胞停止高速、多參數定量剖析和分選的技巧（圖1a），由把持細胞活動的流系統統、光學體系、捕捉發射熒光和散射電子訊號的電子體系和數據采集體系構成。其道理是應用激光作為光源照耀單細胞發生散射光和熒光電子訊號，并將這些光學電子訊號經由過程檢測器讀取、轉換為電子電子訊號輸入，從而對單個細胞停止疾速剖析和挑選。
FACS技巧用于熒光標誌的單細胞高通量測試，天天測試通量可到達108以上。近年來，基于熒光探針、細胞概況展現、生物傳感器等熒光標誌技巧，FACS在卵白質工程和產業菌株育種範疇獲得明顯停頓，例如纖維素酶等定向退化，高產L-半胱氨酸年夜腸桿菌、高產L-賴氨酸谷氨酸棒狀桿菌等典範產業菌株的高通量選育。但是，FACS單細胞表型測試技巧受限于熒光標簽的開闢，以及胞內與胞膜物資的測試，同時流式細胞儀細胞分選前的高壓充電經過歷程和分選經過歷程中的高速放射經過歷程均對細胞發生必定毀傷，致使活氣降落。為了防止這些題目，研討者開闢了雙乳化水包油包水液滴（W/O/W）、凝膠微球（gel-droplet）等技巧，將單細胞包裹進水相液滴或水相微球中停止后續培育和FACS挑選。但是，這些方式由于步調煩瑣、液滴易破損未得以普遍利用。
FACS技巧設備化方面，近年來，我國上海緯冉科技無限公司自立研發的SE420流式細胞分選儀完成了細胞樣本的周全剖析與高通量分選，成都賽雷納醫療科技無限公司研發的小型Sparrow流式細胞儀以及深圳邁瑞生物醫療電子股份無限公司的BriCyte E6流式細胞儀，今朝普通用于單細胞的剖析與檢測。在入口brand方面，美國BD公司的FACS Calibur、FACS Melody、FACS Jazz、FACS Aria系列，美國Beckman Coulter公司的CytoFlex SRT、EPIC XL系列，japan(日本)On-chip Biotechnologies公司的On-chip Sort細胞分選儀均可停止多參數、高辨別率和敏銳度細胞剖析與分選。可見我國FACS全體技巧程度與國外仍有差距，在市場承認度、儀器檢測精度、敏銳度、穩固性及多參數檢測才能等方面有待進步。是以，需不竭加大力度基本研討和技巧立異，加年夜對要害零部件研發的投進，進步儀器的焦點機能和自立可控性，加快技巧轉化和人才培育，晉陞我國在流式細胞術範疇的全體技巧程度。
拉曼激活細胞分選技巧與設備
拉曼激活細胞分選（Raman activated cell sorting，RACS）是基于拉曼光譜檢測的單細胞剖析和分選技巧（圖1b）。拉曼光譜是一種散射光譜，每個散射峰都對應于一種特定的分子鍵振動，是以可以辨認單細胞外部的全景信息，答應對單個細胞停止無損、無標誌的化學剖析，并依據其分子構成停止物理分選，被視為一種疾速、低本錢的單細胞表型測試技巧。依據分選時單細胞的活動狀況，RACS測試分為靜態細胞剖析與捕捉、活動細胞剖析與捕捉2品種型。前者是指在細胞運動或絕對運動的狀況下，基于拉曼光譜信息分選出特定類型細胞至單管中，如拉曼彈射分選（Raman-activated cell ejection，RACE）、重力驅動拉曼光鑷液滴分選（Raman-activated gravity-driven encapsulation，RAGE）等技巧，其上風為可以對接下流的單細胞培育、單細胞測序等研討，但是靜態單點捕捉通量過低。后者是指細胞懸浮在活動相中，在活動狀況下對單細胞停止拉曼光譜檢測，分選搜集上風表型細胞，如拉曼微液滴分選（Raman-activated droplet sorting，RADS）、介電捕捉拉曼激活液滴分選（positive dielectrophoresis-based RADS，pDEP-RADS）等技巧，單細胞在拉曼檢測后跟著活動相活動，經由過程油相剪切構成單細胞液滴進而分選至搜集管，其上風為高通量，更實用于文庫中目的表型細胞的測試。
RACS靜態單細胞測試技巧重要利用于單細胞組學研討，Song等應用該技巧從海水樣品平分離出富含類胡蘿卜素單細胞，并在分別后對單細胞停止測序，發明了新型類胡蘿卜素分解基因；Su等經由過程對分別的單細胞全基因組擴增測序，完成了95%的基因組籠罩度。而RACS活動單細胞測試技巧重要利用于單細胞底物代謝、產品分解和細胞的剖析判定研討，通量天天可到達104以上。在細胞代謝測試中，經由過程應用13C、15N和2H同等位素標誌底物從而轉變分子東西的品質，細胞攝進底物后，拉曼光譜產生變更，完成細胞代謝的剖析研討。例如，Kumar等將13C標誌的糖類物資等添加究竟盤細胞培育基中，經由過程剖析卵白中13C拉曼光譜位移變更，提醒了細胞對碳源底物代謝的克制機制。在胞內產品分解測試中，拉曼光譜可以在無損且非標誌的狀況下同步檢測分歧代謝產品，如色素、淀粉等物資，為高產菌株的高通量挑選和定量剖析供給新思緒。此外，由于每種單細胞拉曼光譜具有特異性，可作為單細胞特有的“分子指紋圖”，進而反應出特定細胞內化學物資成分及含量的多維信息。是以，RACS還被用于單細胞剖析判定，如Yan等聯合機械進修算法和拉曼光譜，在單細胞程度上判定出食源性病原體。
我國拉曼光譜單細胞表型測試設備處于國際領跑位置。青島星賽生物科技無限公司率先開闢了全球首臺高通量流式拉曼分選儀FlowRACS，該設備可以或許直接判定單細胞品種并測試代謝相干表型。吉林長光辰英科技無限公司開闢了PRECI SCS-R300拉曼單細胞分選儀，完成了單細胞辨認與分別研討。
圖像激活細胞分選技巧與設備
圖像激活細胞分選（image activated cell sorting，IACS）是一種基于顯微成像的細胞分選技巧（圖1c）。IACS技巧的焦點在于應用高辨別率顯微成像體系捕捉細胞的圖像，然后經由過程圖像剖析軟件辨認和分類細胞。這些圖像可以供給細胞的鉅細、外形、紋理等信息，常用于特定細胞的高通量分別試驗。例如，Nitta等將三維成像技巧和薄膜微閥流體驅動技巧聯合，獲取高東西的品質的細胞三維圖像，并經由過程薄膜閥驅動目的細胞至搜集管路中，以此完成細胞的圖像剖析和分選。Akihiro等基于IACS技巧，集成了高通量的光學顯微鏡、細胞聚焦、細胞排序和深度進修算法，開闢了iIACS體系，完成了數據采集、處置、智能決議計劃和履行的主動化操縱。Zhao等將iIACS體系與人工智能（AI）圖像處置聯合，進一個步驟進步了基于圖像的單細胞分選通量。
基于IACS技巧研發的設備包含美國BD公司的ImageStream X MkII體系、美國Amnis Corporation 公司的ImageStream體系、美國Beckman Coulter 公司的CytoFLEX系列產物，完成了分選前的細胞圖像信息采集。我國青島星賽生物科技無限公司開闢了EasySort AUTO體系，基于顯微成像與AI圖像剖析技巧，在該體系中，AI幫助目的檢測模子完成了對目的細胞的高精度辨認，體系集成的光鑷模塊可以或許將細胞主動轉移到搜集管中。今朝，我國在IACS範疇的研討成長敏捷，但由于起步較晚，還處于基本技巧的開闢和優化階段。是以，需求加大力度基本研討、增進跨學科一起配合與國際一起配合交通，以慢慢減少我國IACS設備與國際進步前輩程度的差距。
磁激活細胞分選技巧與設備
磁激活細胞分選技巧 （magnetic activated cell sorting，MACS）是一種基于磁場和磁性標誌的細胞分別技巧（圖1d），其焦點在于應用超順磁性微珠標誌特異性抗體，這些抗體可以或許辨認并聯合目的細胞概況的特定抗原，一旦標誌完成，細胞混雜物被引進磁場中，磁性微珠會被敏捷吸附到磁場的一側，從而將標誌的細胞與未標誌的細胞分別，其通量為天天109樣品。MACS分別方法疾速、高效，且對細胞的毀傷小，合適于后續的細胞培育、分子剖析，常用于植物細胞的分別。Munz等應用MACS技巧勝利分別小鼠脾細胞中的樹突狀細胞（DCs），并研討了其在免疫應對中的感化。但是，該技巧面對特異性抗體標誌的題目，難以完成細胞的普適性測試。在設備研討中，德國Miltenyi Biotec公司的AutoMACS、美國Thermo Fisher Scientific公司的Dynabeads，均勝利完成了磁激活細胞分選裝備貿易化。此外，美國BD公司將MACS與FACS技巧聯合，開闢了FACSAria III產物，為用戶供給了更多的選擇。可見國際MACS設備財產化水平絕對較低，缺少具有國際競爭力的brand，是以需求投進更多資本停止MACS技巧的基本研討，以晉陞我國MACS技巧立異才能。
基于FACS、RACS、IACS、MACS技巧道理開闢的非培育類型單細胞高通量表型測試典範貿易化妝備如表1所示。
微液滴高通量培育包養網技巧與測試設備
液滴微流控技巧（droplet-based microfluidics）是一種在微納米標準上操控和處置微液滴的技巧，經由過程在微通道內操控互不相溶的多相流體，基于微流控芯片完成皮升（pL）至微升（μL）標準液滴的單位操縱，包含液滴的天生、注進、決裂、融會、電子訊號檢測和分選等。與單細胞測試東西比擬，液滴可以作為自力的反映單位培育單細胞，并停止后續胞內、胞膜、胞外、無細胞系統相干物資的高通量檢測與分選，具有體積小、單疏散性好、無穿插淨化等長處。典範形式菌株如年夜腸桿菌、酵母菌等直徑在10微米以下，100皮升以內的液滴即可知足培育需求；而植物細胞、放線菌等直徑在10微米以上，需求將液滴體積增添至幾百皮升甚至納進級別才可以停止培育，絲狀真菌菌絲密集堅固，在皮納升液滴中培育易形成液滴之間的融會，凡是需求微升液滴系統才可持久培育。可見，分歧表型測試場景下的液滴微反映器標準需求分歧，下文將分辨論述皮納升液滴與微進級液滴測試技巧與設備。
皮納升液滴培育技巧與測試設備
皮納升液滴是指體積范圍在1皮升—100納升的液滴，普通以油相作為持續相，水相作為疏散相，當兩相流體顛末毛細管共軸聚焦、微流控芯片活動聚焦等構造時，油相剪切水相構成平均的單疏散液滴。經由過程泊松分布實際，單細胞被包裹在液滴中停止發展代謝，隨后基于分歧的分選技巧，如熒光激活液滴分選（FADS）、吸光度激活液滴分選（AADS）、質譜激活液滴分選（MADS）、成像激活液滴分選（IADS）完成目的表型細胞的分選和搜集。
FADS技巧是今朝應用最普遍的皮納升液滴挑選技巧（圖2a），最早于2009年被提出，顛末10余年的成長，技巧不竭迭代進級，曾經構成較為成熟的貿易化妝備。FADS技巧由驅動體系、成像體系、光學體系、電學體系、微流控芯片體系等構成，經由過程微泵驅動液滴活動，激光器激起液滴熒光后，光學體系將光電子訊號轉化為電學電子訊號輸入；當電子訊號位于設定的閾值時，經由過程介電泳等方法將液滴分選至芯片搜集通道。該技巧中的要害挑釁在于開闢熒光探針，完成熒光電子訊號與細胞表型的耦合。針對細胞表達的生物酶活性測試，開闢了熒光基團潤飾底物檢測系統；針對小分子代謝物，開闢了酶聯熒光探針傳感器、全細胞類與擬熒光卵白類生物傳感器，極年夜拓展了FAD包養S技巧在分解生物制造範疇的利用。
由于FADS技巧需求開闢響應的熒光檢測系統，在詳細應用場景遭到必定限制，近年來還成長了AADS、MADS、IADS等無標簽檢測分選技巧。AADS技巧是基于接收光譜法的微液滴檢測技巧（圖2b），Gielen等經由過程在液滴檢測口兩側，芯片上內置兩根光纖，分辨銜接光源和檢測器，液滴流過期惹起光譜接收變更輸入電子訊號，依據光接收變更對感愛好的目的液滴停止分選。該裝配用于苯丙氨酸脫氫酶的定向退化，酶活性增添了2.7倍。但是，由于皮納升體積液滴反映器檢測光程過短、檢出電子訊號艱苦，AADS技巧仍處于底層技巧研討階段。MADS技巧是將微流控芯片經由過程接口銜接ESI電離噴霧質譜（圖2c），在微流控芯片上完成液滴的決裂，一部門液滴經由過程接口進進質譜停止損壞性檢測，另一部門液滴備份。當質譜輸入合適預期的電子訊號時，基于介電泳將備份的液滴分選至芯片搜集通道，該裝配用于含有體表面達轉氨酶的液滴挑選，完成了0.7個/秒的液滴挑選速度，正確率為98%。IADS技巧是一種基于液滴圖像辨認、處置與剖析的無標誌分選技巧（圖2d），起首將細胞細胞懸浮液與試劑混雜，停止單個細胞的封裝，在微周遭的狀況中培育后經由過程顯微成像、熒光成像技巧測試培育后的細胞群。Zang等經由過程對液滴成像，檢測液滴內放線菌的發展量，完成了100個/秒目的液滴的分選。
國際外報道了浩繁基于FADS技巧的貿易化皮升納液滴設備。我國洛陽華清天木生物科技無限公司開闢了貿易化的高通量皮進級液滴單細胞分選體系DREM cell，完成了天天超百萬液滴的挑選通量。Ma等基于該裝備將酯酶對映體選擇性進步了700倍以上。Yu等經由過程在目的卵白上添加四半胱氨酸，應用其與雙砷反映發生熒光電子訊號，將排泄卵白產量進步2.5倍以上。Li等經由過程構建液滴天生、注進、分選流程，聯合生物傳感器，有用進步了目的小分子等代謝物包養網的產量。DREMcell還用于微生物培育組學研討，如蜜蜂腸道菌群培育、作物致病拮抗菌株的資本發掘。英國Sphere Fluidics公司研制了納進級Cyto-Mine裝備，液滴操縱體積為0.3納升，是一款單細胞包裹、檢測、分選與克隆驗證集成于單一平臺的單細胞剖析挑選儀器，常用于疾速檢測單個細胞的外泌分子（如IgG、抗原）等，然后依據液滴熒光電子訊號強度選擇特定的單細胞。此外，浙江達普生物技巧無限公司的CytosparkTM MSP皮進級液滴體系、深圳華年夜基因股份無限公司MGIDS-1000P多效能液滴分選一體機、浙江墨卓生物科技無限公司的MobiNova-S1單細胞液滴分選儀、年夜連華微科技無限公司的HW-SeaBreeze X等均完成了皮納升液滴分選技巧與設備開闢。上海濤烜迷信儀器無限公司基于IADS技巧研發了Hypercell高通量單細胞分選平臺，天天可測試105—106發生排泄物的目的單細胞。
微進級液滴培育技巧與測試設備
微進級液滴培育技巧指的是基于微進級別體積的油包水液滴的單細胞培育和分選技巧，天天可以完成104—105個樣本的測試。在培育方面，微進級液滴順次搜集于透氣性管路中，管壁傑出的氣體交流機能為細胞培育供給了硬件基本。同時由于微升液滴比皮納升液滴體積更年夜，是以可以或許支撐更長時光、更多品種（放線菌、霉菌等年夜型細胞）的微生物培育，微生物濃度到達105 CFU/mL以上。在檢測與分選方面，微進級液滴可搭載吸光度、熒光、質譜等各類檢測方法，完成細胞的多表型測試。在分選方面，慣例應用的電場、光鑷等難以發生足夠年夜的驅動力將液滴分包養網選至搜集通道。本文作者團隊開闢了重力場驅動微升液滴至微孔板的分選與搜集方式，構成了我國具有自立常識產權的微升液滴分選技巧。
我國洛陽華清天木生物科技無限公司開闢了貿易化微生物微液滴培育體系MMC與高通量微進級液滴培育組學體系MISScell設備。MMC體系重要用于微生物的持續退化研討，經由過程集成液滴辨認、光譜檢測、微流控芯片和進樣模塊等效能，完成了對微生物液滴的準確操縱，包含產生、培育、監測、朋分、融會和分選等經過歷程。MMC液滴體積為2—3微升，一批次發生200個液滴培育單位并可持續傳代15天以上，終極分選出具有明顯發展上風的底盤細胞。MMC已勝利利用于耐高濃度D-山梨醇和耐低溫Gluconobacter oxydans菌株、甲醇應用型年夜腸桿菌等菌株順應性退化。MISScell體系重要用于單細胞高通量培育挑選研討，每批次天生約5 000個2微升單細胞液滴，液滴存儲在高透氣性管路中停止細胞培育（0—8天），經由過程光學電子訊號（如光學密度、熒光等）檢測分選，搭載機械臂搬運孔板，一批次最多可以搜集1 000株精良表型細胞。本文作者團隊應用帶有熒光標誌的年夜腸桿菌驗證了MISScell基于泊松分布包裹單細胞的可行性，并應用該設備完成了谷氨酸棒狀桿菌的高通量挑選，從502株漸變體平分選出的上風菌株谷氨酸產量進步了25%以上。此外，法國MilliDrop公司的Milidrop Analyzer液滴培育儀也是一款微進級液滴設備，每批次可以天生102—103個細菌、酵母等單細胞微生物液滴，在追蹤細菌在分歧抗生素壓力下的順應性退化、量化腸道細菌的多樣性等迷信研討中獲得利用。
基于FADS、AADS、MADS、IADS技巧道理開闢的培育類型高通量表型測試典範貿易化液滴微流控設備如表2所示。
微腔室高通量培育技巧與測試設備
微腔室反映器是指基于微加工技巧在硅、玻璃等基板上制作微孔陣列，依據分歧需求制作分歧外形的腔室，這些腔室具有無菌透氣、通明性、低毒性等特色以知足單細胞的培育與代謝。例如，聚合物聚二甲基硅氧烷（PDMS）資料具有疏松多孔、易于加工、生物兼容性好、通明性高級長處，普遍用于細胞的發展代謝察看，其微孔體積包含皮升至微進級別，籠罩微生物到植物細胞所需反映器的體積。微腔室生物反映器中的單細胞研討包含單細胞的捕捉、培育和檢測分選，單細胞捕捉可經由過程重力驅動、無限濃縮法、光電驅動等技巧方式將單個細胞導進微腔室（圖3a），接著對微腔室四周周遭的狀況停止合適的溫度把持和氧氣供給，知足細胞在微腔室中的培育需求，最后經由過程熒鮮明微等技巧，對細胞的發展代謝狀況停止持續察看剖析，進而遴選出適合的目的細胞（圖3b）。
皮納升微腔室培育技巧與測試設備
皮納升微腔室是指經由過程數值模仿和實際剖析的方式對微流控芯片尺寸停止準確design的皮納升渺小孔洞陣列。當樣品懸液通進到芯片后，依據泊松分布道理，單 TC:sugarpopular900
